Numération cellulaire (chambre de comptage)
Comptage en chambre (Neubauer, Malassez) en cellules/mL, avec la viabilité au bleu trypan et l’incertitude de Poisson.
Résultat
1 × 10⁶ /mL
- Calcul
- C = 200 / 0,4 µL × 2 = 1000 /µL
- Incertitude de comptage
- ±7,0711 %
- Concentration par microlitre
- 1000 /µL
- Volume compté
- 0,4 µL
Remarque
La suspension d’origine contient 1 × 10⁶ cellules/mL.
Calcul, hypothèses et sources
PrésentationConcentration en cellules/mL de la suspension d’origine, à partir d’un comptage en chambre et du facteur de dilution.
Concentration en cellules/mL de la suspension d’origine, à partir d’un comptage en chambre et du facteur de dilution. Chambres préréglées : grand carré de Neubauer improved (0,1 µL) et rectangle de Malassez (0,01 µL) ; toute autre géométrie se saisit. La viabilité au bleu trypan est calculée si les cellules mortes sont comptées. L’incertitude de Poisson vaut 1/√N, soit ±10 % pour cent cellules.
Méthode & formulesC (cellules/µL) = comptées / (unités × volume d’unité) × dilution
Le volume parcouru vaut unités × volume d’unité ; le facteur de dilution ramène la concentration à l’échantillon d’origine.
- Chambre de comptage (hématimètre)
- une lame quadrillée, creusée à profondeur calibrée ; chaque motif de grille délimite un volume connu sous la lamelle.
- Neubauer improved
- la chambre la plus répandue : neuf grands carrés de 1 mm², profondeur 0,1 mm, soit 0,1 µL par grand carré.
- Malassez
- cent rectangles de 0,01 µL, soit 1 µL pour la grille entière ; chambre usuelle des laboratoires francophones.
- Bleu trypan
- colorant d’exclusion, qui n’entre que dans les cellules mortes : vivantes réfringentes, mortes bleues. Il tue les cellules en quelques minutes ; compter rapidement après le mélange.
Domaine de validitéLe calcul suppose une suspension homogène (vortexer, pipetter sans laisser sédimenter), une lamelle plaquée à la bonne profondeur (franges d’interférence visibles) et une convention de bords constante (cellules à cheval sur deux côtés seulement).
Le calcul suppose une suspension homogène (vortexer, pipetter sans laisser sédimenter), une lamelle plaquée à la bonne profondeur (franges d’interférence visibles) et une convention de bords constante (cellules à cheval sur deux côtés seulement). Les amas comptés comme une cellule sous-estiment la concentration ; les dissocier avant le comptage. L’incertitude de Poisson est un minimum, auquel s’ajoutent les biais de pipettage et d’homogénéité.
Incertitude de comptageLes cellules se répartissent au hasard dans la grille : le comptage suit une loi de Poisson d’écart-type √N, et l’incertitude relative 1/√N ne dépend ni de l’opérateur ni du microscope.
Les cellules se répartissent au hasard dans la grille : le comptage suit une loi de Poisson d’écart-type √N, et l’incertitude relative 1/√N ne dépend ni de l’opérateur ni du microscope. Elle vaut ±32 % pour 10 cellules, ±20 % pour 25, ±10 % pour 100, ±5 % pour 400. Viser une centaine de cellules au total, diluer si la grille déborde, compter plus d’unités si elle est clairsemée.
Lecture du résultatAprès décongélation, une viabilité inférieure à 90 % est ordinaire ; en culture de routine, sous 70 %, elle signale un problème.
Après décongélation, une viabilité inférieure à 90 % est ordinaire ; en culture de routine, sous 70 %, elle signale un problème.