Calculateur d'amorces PCR

Formule d'approximation courante pour un simple brin d'ADN en extrémité 5'-OH (nA, nT, nC, nG désignant le nombre de chaque base). Ce n'est pas une masse monoisotopique exacte, et elle n'est calculée que pour une amorce sans aucune base ambiguë (voir la section Limites).

La polymérase étend l'amorce à partir de son extrémité 3'. Une complémentarité (avec l'autre amorce, ou avec elle-même) qui touche cette extrémité peut être étendue et amorcer une réaction parasite ; une complémentarité purement interne, plus en amont, est nettement moins problématique. C'est pourquoi cet outil distingue toujours la complémentarité globale (meilleur alignement, où qu'il soit) de la complémentarité en 3' (pondérée plus lourdement dans l'évaluation du risque).

GC clamp

· présence d'une base G ou C en position 3' terminale, généralement considérée favorable à la stabilité de l'amorçage. Un repère de conception courant, pas une garantie.

Compatibilité des Tm

· deux amorces d'une même paire fonctionnent mieux avec des températures de fusion proches (un écart de quelques degrés est couramment toléré) : un écart important favorise l'amplification préférentielle d'un seul brin.

Hétérodimère

· appariement indésirable entre les deux amorces elles-mêmes, qui les consomme au lieu de la cible. D'autant plus problématique s'il implique une extrémité 3'.

Auto-complémentarité et épingle à cheveux

· une amorce peut se lier à elle-même (dimère) ou se replier sur elle-même (structure en épingle), la rendant partiellement ou totalement indisponible pour s'hybrider à sa cible.

En PCR, deux amorces courtes encadrent la région à amplifier : l'amorce forward s'hybride sur le brin complémentaire dans le sens 5'→3' de la région d'intérêt, l'amorce reverse s'hybride sur le brin opposé, orientée en sens inverse. Cet outil accepte l'une, l'autre. Ou les deux, l'analyse d'une seule amorce reste utile pour vérifier ses propriétés individuelles avant même d'avoir choisi son partenaire.

La température de fusion est calculée par le modèle plus-proche-voisin de SantaLucia (1998), ΔH, ΔS. Concentration effective et correction saline explicites, partagés entre les deux amorces. Dès que la séquence le permet, avec l'estimation simple (règle de Wallace ou formule ajustée au GC) affichée systématiquement en comparaison, jamais comme un substitut silencieux. Une base IUPAC ambiguë fait échouer le calcul thermodynamique pour cette amorce ; si l'autre amorce de la paire y reste éligible, comparer directement les deux Tm mélangerait deux méthodes différentes. L'outil le signale explicitement plutôt que de comparer silencieusement. Ce modèle ne prend en compte que les cations monovalents (Na⁺/K⁺), pas le magnésium ni les dNTP, et suppose deux brins en concentration égale (voir temperature-fusion-amorce pour le détail des hypothèses et leurs limites).

La complémentarité entre amorces (dimères) et la structure en épingle à cheveux restent des heuristiques structurelles, distinctes du Tm thermodynamique ci-dessus : cet outil ne reproduit ni Primer3 ni OligoAnalyzer sur ce point. La complémentarité est détectée par un balayage sans notion de décrochement (gap) ; la structure en épingle, par un algorithme naïf volontairement limité aux longueurs d'amorce. Point important : les mentions « risque faible / modéré / élevé » comptent des paires de bases appariées consécutives et la position de l'appariement (une extrémité 3' pèse plus lourd, parce que la polymérase peut l'étendre). Elles n'évaluent aucune stabilité thermodynamique. Or 4 paires G/C sont nettement plus stables que 6 paires A/T (ΔG°37 d'environ −3,6 contre −2,9 kcal/mol) : un appariement riche en G/C peut donc être sous-estimé, et un appariement riche en A/T surestimé. Les outils qui raisonnent en ΔG (Primer3, OligoAnalyzer) restent la référence pour trancher un cas limite sur les dimères et épingles. Chaque métrique heuristique est signalée comme telle : ce sont des indicateurs de risque à interpréter, jamais des résultats de validation expérimentale. Une base IUPAC ambiguë produit un intervalle (GC, Tm simple) ou rend un calcul indisponible (masse moléculaire, Tm thermodynamique) plutôt qu'une valeur centrale inventée. Enfin, au-delà de 300 nucléotides (bien plus qu'aucune amorce réelle) la recherche de complémentarité et d'épingle est désactivée et signalée comme telle : ces analyses coûtent un temps qui croît très vite avec la longueur, et n'ont de sens que sur une amorce, pas sur une séquence cible collée par erreur.