Calculateur d'amorces PCR

Analyse d'une amorce forward, d'une amorce reverse ou des deux : longueur, composition en bases, taux GC, température de fusion (modèle plus-proche-voisin de SantaLucia, 1998, et estimation simple), masse moléculaire approximative, GC clamp, homopolymères et répétitions simples. Pour une paire s'y ajoutent l'écart de Tm, la complémentarité entre amorces (globale et en 3'), l'auto-complémentarité et le risque d'épingle à cheveux. Pas de conception automatisée d'amorces sur un génome.

Approximation courante pour un ADN simple brin à extrémité 5'-OH (nA, nT, nC, nG : nombre de chaque base), et non masse monoisotopique exacte.

La polymérase étend l'amorce à partir de son extrémité 3'. Une complémentarité qui touche cette extrémité, avec l'autre amorce ou avec elle-même, peut être étendue et amorcer une réaction parasite. Une complémentarité interne pose nettement moins de problème.

GC clamp

base G ou C en position 3' terminale, généralement considérée comme favorable à la stabilité de l'amorçage.

Compatibilité des Tm

les deux amorces d'une paire fonctionnent mieux avec des Tm proches ; un écart de quelques degrés est couramment toléré. Un écart important favorise l'amplification préférentielle d'un seul brin.

Hétérodimère

appariement des deux amorces entre elles, qui les consomme aux dépens de la cible.

Auto-complémentarité et épingle à cheveux

appariement d'une amorce avec une autre copie d'elle-même (auto-dimère) ou repli sur elle-même (épingle). L'amorce devient en partie ou totalement indisponible pour sa cible.

La Tm est calculée par le modèle plus-proche-voisin de SantaLucia (1998), avec ΔH et ΔS explicites, une concentration effective et une correction saline communes aux deux amorces. L'estimation simple (règle de Wallace ou formule ajustée au GC) est donnée en comparaison. Une base IUPAC ambiguë rend le modèle thermodynamique indisponible pour l'amorce concernée. Le modèle ne tient compte que des cations monovalents (Na⁺/K⁺), ni du magnésium ni des dNTP, et suppose deux brins en concentration égale (hypothèses détaillées dans temperature-fusion-amorce).

La complémentarité entre amorces est détectée par un balayage sans décrochement (gap). Les mentions « risque faible / modéré / élevé » comptent les paires de bases appariées consécutives et tiennent compte de leur position (une extrémité 3' pèse plus lourd). Elles n'évaluent pas la stabilité thermodynamique. Une série de 4 paires G/C est nettement plus stable qu'une série de 6 paires A/T (ΔG°37 d'environ −3,6 contre −2,9 kcal/mol) ; un appariement riche en G/C peut être sous-estimé, un appariement riche en A/T surestimé. Primer3 et OligoAnalyzer évaluent cette stabilité en ΔG. Au-delà de 300 nucléotides, la recherche de complémentarité et d'épingle est désactivée : elle concerne des amorces, pas une séquence cible.