Concentration et pureté ADN/ARN (A260)
Absorbance à 260 nm en concentration (ng/µL), et pureté lue aux rapports 260/280 et 260/230, avec leurs seuils.
Spectre
trois mesures- Calcul
- C = A260 × 50 × 1 = 1 × 50 × 1 = 50 ng/µL
- Rapports
- A260/A280 = 1 / 0,556 = 1,7986
- A260/A230 = 1 / 0,476 = 2,1008
Remarques (2)
Le calcul n’utilise que les trois longueurs d’onde saisies, sans interpolation.
La bande grise est la plage de référence du classement ; hors bande ne veut pas dire inutilisable.
Résultat
calcul continu- Rapport 260/280A260/A280
- 1,7986 (attendu)
- Rapport 260/230A260/A230
- 2,1008 (attendu)
- Facteur de conversionf
- 50 µg/mL
- Facteur de dilutiond
- 1
L’échantillon non dilué contient 50 ng/µL.
Calcul, hypothèses et sources
PrésentationUne unité d’absorbance à 260 nm correspond à 50 µg/mL d’ADN double brin, 40 pour l’ARN et 33 pour l’ADN simple brin ; la concentration tient compte du facteur de dilution.
Une unité d’absorbance à 260 nm correspond à 50 µg/mL d’ADN double brin, 40 pour l’ARN et 33 pour l’ADN simple brin ; la concentration tient compte du facteur de dilution. Les rapports 260/280 et 260/230 signalent les contaminants, avec les seuils publiés (1,8 pour l’ADN, 2,0 pour l’ARN). Un rapport sans absorbance mesurée à 280 ou 230 nm n’est pas évalué.
Méthode & formulesC (µg/mL) = A260 × facteur × dilution
Loi de Beer-Lambert à 260 nm, en cuve de 1 cm : des facteurs conventionnels convertissent l’absorbance en concentration massique. Le ng/µL et le µg/mL sont la même unité.
- A260
- l’absorbance à 260 nm, maximum d’absorption des bases nucléiques.
- Rapport 260/280
- sensible aux protéines et au phénol, qui absorbent à 280 nm. Attendu vers 1,8 pour l’ADN, 2,0 pour l’ARN.
- Rapport 260/230
- sensible aux sels chaotropiques, à l’EDTA et au phénol, qui absorbent à 230 nm. Attendu entre 2,0 et 2,2.
- Facteur de dilution
- le rapport entre l’échantillon et la solution mesurée. Dilué au dixième, la concentration vraie vaut dix fois la concentration lue.
Domaine de validitéLes facteurs supposent une composition en bases moyenne et une cuve de 1 cm ; pour un oligonucléotide court, le coefficient d’extinction de la séquence est plus juste.
Les facteurs supposent une composition en bases moyenne et une cuve de 1 cm ; pour un oligonucléotide court, le coefficient d’extinction de la séquence est plus juste. La photométrie est fiable entre 0,1 et 1 unité d’absorbance environ. Au-delà, il faut diluer ; en deçà, le bruit domine et un dosage fluorimétrique par intercalant convient mieux.
Rapports de pureté et contaminantsUn 260/280 bas signale des protéines résiduelles d’une extraction au phénol-chloroforme ; un 260/230 bas, les sels de guanidine des kits sur colonne ou l’EDTA du tampon.
Un 260/280 bas signale des protéines résiduelles d’une extraction au phénol-chloroforme ; un 260/230 bas, les sels de guanidine des kits sur colonne ou l’EDTA du tampon. Remèdes : relaver la colonne, reprécipiter, ou changer de blanc. Des rapports corrects ne garantissent pas l’intégrité ; nucléotides libres et ADN dégradé absorbent aussi à 260 nm, et seule une électrophorèse la vérifie.